中國運動醫(yī)學(xué)雜志2016 年4 月第35 卷第4 期Chin J Sports Med，Apr. 2016，Vol.35，No.4
跑臺運動對兔前交叉韌帶斷裂后膝關(guān)節(jié)軟骨的影響
鐘名金劉振龍張繼英李玳胡曉青敖英芳
北京大學(xué)第三醫(yī)院運動醫(yī)學(xué)研究所（北京100191）
摘要目的：建立一種可有效用于研究兔前交叉韌帶（ACL）斷裂后運動對軟骨影響的實驗運動模型，進(jìn)而研究早期運動對兔ACL 斷裂后關(guān)節(jié)軟骨的影響。方法：45 只成年新西蘭大白兔（4~5 月齡，重2.5~3kg），隨機(jī)平均分為：I 組，假手術(shù)自由活動組（Sham 組）；II 組，前交叉韌帶切斷（ACL transection）自由活動組（ACLT 組）；III 組，前交叉韌帶切斷跑臺運動組（ACLT with exercise，ACLT+Ex 組）。運動組在實驗跑臺上定期運動，運動始于術(shù)后第5 天，運動強(qiáng)度為5 天/周，10 分鐘/天，跑臺速度為0.3 英里/小時（約8 米/分鐘）。分別于術(shù)后第2、3、4 周每組處死5 只兔子， 對兔膝關(guān)節(jié)股骨髁軟骨進(jìn)行印度墨汁染色大體觀評分、組織學(xué)和二型膠原**組化染色并使用國際骨關(guān)節(jié)炎研究會（OARSI）軟骨損傷評分系統(tǒng)進(jìn)行軟骨損傷評估。結(jié)果：術(shù)后2 周，Sham 組、ACLT 組和ACLT+Ex 組未見明顯軟骨損傷；術(shù)后3 周、4 周，Sham 組軟骨未見明顯損傷退變；ACLT 組和ACLT+Ex 組均出現(xiàn)軟骨損傷，在大體觀評分和OARSI 分級、分期、總分上分別與Sham 組存在顯著統(tǒng)計學(xué)差異；ACLT 組與ACLT+Ex 組在大體觀評分和OARSI 軟骨損傷評分上無統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)論：跑臺運動是可用于研究兔ACL 斷裂后對關(guān)節(jié)軟骨損傷研究的有效實驗運動模型；兔ACL 斷裂后早期出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨損傷，但與籠養(yǎng)自由活動相比，實驗跑臺運動對關(guān)節(jié)軟骨損傷進(jìn)程無影響，表明ACL 斷裂后早期進(jìn)行合理運動與康復(fù)不會加重膝關(guān)節(jié)軟骨損害。
關(guān)鍵詞前交叉韌帶斷裂；軟骨損傷；運動；實驗跑臺
前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）斷裂是臨床中十分常見的運動創(chuàng)傷。ACL 斷裂后造成膝關(guān)節(jié)活動時失去維持脛骨前向穩(wěn)定的限制力， 關(guān)節(jié)不穩(wěn)引發(fā)關(guān)節(jié)軟骨退變加劇， *終導(dǎo)致骨性關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA） 的發(fā)生[1]。文獻(xiàn)報道，ACL 斷裂后OA 的發(fā)生率、嚴(yán)重程度與傷后關(guān)節(jié)活動方式和強(qiáng)度有密切關(guān)系[2]。動物模型可以很好地反映ACL 斷裂后關(guān)節(jié)軟骨損傷的病理變化過程。兔膝關(guān)節(jié)與人膝關(guān)節(jié)的解剖相類似，并且兔易獲得、易飼養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)成本低，因此兔前交叉韌帶切斷（anterior cruciate ligamenttransection，ACLT）是模擬ACL 斷裂和進(jìn)行相關(guān)實驗研究的合適模型[3]。實驗?zāi)Ｐ驮瓌t上應(yīng)該盡可能模擬臨床患者的日常活動或運動情形。既往文獻(xiàn)報道的關(guān)于兔ACL 斷裂后的活動只限于籠養(yǎng)自由活動[4]，不能反映臨床上人的日?；顒雍瓦\動， 也無法進(jìn)一步研究運動條件下軟骨損傷的病理變化。因此需要建立一種用于兔ACL 斷裂后的運動模型， 來模擬ACL 斷裂后的運動，進(jìn)而觀察ACL 傷后運動對關(guān)節(jié)軟骨的影響。本研究通過切斷兔ACL 并予以跑臺運動來模擬ACL 斷裂后的運動， 觀察兔ACL 斷裂后早期運動對關(guān)節(jié)軟骨的影響，從而為ACL 斷裂后進(jìn)行早期合理運動和康復(fù)提供一定的理論基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物部提供成年新西蘭大白兔，4~5 月齡，體重2.5~3 kg，共45 只，由專業(yè)飼養(yǎng)員分籠飼養(yǎng)，所有動物均可充分獲得食物和飲用水。
1.2 兔運動跑臺及運動方案
實驗跑臺采用兔運動訓(xùn)練跑臺（北京智鼠多寶生物科技公司）。根據(jù)實驗設(shè)計要求，跑臺主要由跑道、電機(jī)、操作臺、升降機(jī)等構(gòu)成。跑臺內(nèi)含3 個跑道，規(guī)格為1560 mm×996 mm×280 mm， 長度適用于兔的奔跑，跑道速度由電動馬達(dá)驅(qū)動，速度可無級調(diào)整，范圍為1~40 米/分（圖1）。兔運動開始于手術(shù)后第5 天，每周5天，每天10 分鐘，跑臺速度為0.3 英里/小時（約8 米/分鐘）。Oyen-Tiesma 等[5]研究認(rèn)為此運動方案符合兔的運動量， 可**有效地用于兔運動損傷的相關(guān)研究
中而不會產(chǎn)生任何相關(guān)并發(fā)癥或繼發(fā)性損傷。自由活動組**于飼養(yǎng)籠（550 mm×450 mm×400 mm） 內(nèi)活動。
1.3 實驗動物與分組
兔經(jīng)過1 周的適應(yīng)性籠養(yǎng)后， 隨機(jī)均分為3 組：I組，假手術(shù)自由活動組（Sham 組）；II 組，前交叉韌帶切斷自由活動組（ACLT 組）；III 組，前交叉韌帶切斷跑臺運動組（ACLT with exercise，ACLT+Ex 組）。每組分別于術(shù)后2、3、4 周處死兔子獲取膝關(guān)節(jié)， 每次每組5 只兔子。
1.4 手術(shù)方法（圖2）
采用耳緣靜脈注射20%烏拉坦（5 ml/kg）對動物進(jìn)行全身麻醉，將膝關(guān)節(jié)固定、備皮、**及鋪巾，經(jīng)膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)髕旁切口，逐層分離至打開關(guān)節(jié)腔，將髕骨向外側(cè)脫位后屈膝下完全暴露前交叉韌帶， 用眼科剪在韌帶中段予以切斷并剪除2 mm 韌帶組織防止粘連**，行Lachman 試驗確定韌帶完全切斷， 生理鹽水沖洗關(guān)節(jié)腔，將髕骨復(fù)位，嚴(yán)密縫合關(guān)節(jié)腔及皮膚。假手術(shù)組動物采用相同的切口在相同條件下切開皮膚和打開關(guān)節(jié)腔，暴露前交叉韌帶不予以切斷，生理鹽水沖洗后關(guān)閉傷口。為防止術(shù)后關(guān)節(jié)感染，術(shù)后予以每只動物肌注40 萬單位的青霉素，連續(xù)3 天。
1.5 大體形態(tài)觀察
解剖膝關(guān)節(jié)，充分暴露股骨髁，觀察股骨內(nèi)外髁軟骨的大體形態(tài)， 進(jìn)行印度墨汁染色后并采用如下評分系統(tǒng)進(jìn)行評價[6]：1 分：軟骨表面光滑，色澤光鮮，無墨汁殘留；2 分：軟骨表面裂隙，范圍0~4 mm；3 分：軟骨表面裂隙，范圍4~8 mm；4 分： 軟骨表面裂隙，范圍大于8 mm；5 分：軟骨全層磨損，深度0~2 mm；6 分：軟骨全層磨損，深度2~5 mm；7 分：軟骨全層磨損，深度大于5 mm。股骨內(nèi)外髁軟骨損傷墨汁染色的平均分代表股骨髁軟骨損傷分值。
1.6 組織學(xué)和Ⅱ型膠原**組化染色
大體觀察后將兔膝關(guān)節(jié)固定于4%的中性多聚甲醛固定溶液中，固定72 小時。標(biāo)本經(jīng)固定后自來水沖洗，用10%甲酸脫鈣液進(jìn)行脫鈣，每日更換脫鈣液至脫鈣充分，標(biāo)本用蒸餾水漂洗，至恢復(fù)中性PH。修整股骨內(nèi)外髁軟骨組織，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋后，以5 μm/層切片， 行蘇木精-伊紅染色（hematoxylin and eosin，HE）、甲苯胺藍(lán)染色（Toluidine Blue）。組織學(xué)評分采用國際骨關(guān)節(jié)炎研究會（Osteoarthritis Research SocietyInternational，OARSI）推出的關(guān)節(jié)軟骨組織病理學(xué)評分系統(tǒng)[7]，此評分系統(tǒng)能準(zhǔn)確評估軟骨損傷情況。HE 染色主要用于觀察軟骨的層次結(jié)構(gòu)， 甲苯胺藍(lán)可以觀察軟骨蛋白多糖的含量。該評分系統(tǒng)根據(jù)軟骨損傷嚴(yán)重性和深度將軟骨損傷分為0~6 級（Grade0~Grade6）（表1），根據(jù)軟骨損傷范圍將軟骨損傷分為0~4 期（Stage0~Stage4）（表2）， *終的OARSI 總分為分級與分期的乘積（0~24 分）（表3）。將股骨內(nèi)外髁軟骨損傷分級、分期和總分的平均分代表股骨髁軟骨損傷分值。同時對軟骨組織切片采用“二步法”進(jìn)行II 型膠原COL.II）**組化染色用于觀察軟骨基質(zhì)的II 型膠原變化。
1.7 統(tǒng)計學(xué)處理
數(shù)據(jù)采用中位數(shù)（*小值， *大值） 表示， 采用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，兩組中位數(shù)的比較采用非參數(shù)Mann-Whitney 檢驗進(jìn)行，三組間兩兩比較調(diào)整了檢驗水準(zhǔn)，P<0.05 差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1 術(shù)后2 周軟骨損傷情況
術(shù)后2 周，Sham 組、ACLT 組和ACLT+Ex 組軟骨均未見明顯損傷，軟骨表面光滑，色澤鮮亮，無墨汁殘留。HE 組織學(xué)染色表現(xiàn)為軟骨結(jié)構(gòu)清晰，軟骨結(jié)構(gòu)完整。甲苯胺藍(lán)染色表現(xiàn)為軟骨染色均一，糖原含量無減少。II 型膠原**組化染色未見II 型膠原丟失。軟骨墨汁染色評分和OARSI 分級、分期及總分統(tǒng)計結(jié)果表明三組間無統(tǒng)計學(xué)差異（圖3）。
